Why do we need model systems
All cells are descended from a common ancestor
Simple systems to study a biological question; Extrapolate results to higher organisms
Advantageous characteristics found in model organisms Amenable to genetic manipulation; Reproduce rapidly; Transparent; Defined cell lineage…
Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition (© Garland Science 2008)
基因表达的定量分析
基因功能性产物(包括蛋白、RNA分子)含量的变化是真核细胞尤其是哺乳动物细胞基因表达调控的主要方面。定量地确定基因表达水平的变化,是现代细胞分子生物学研究的基本要求。
基因表达的上调和下调技术
为确定基因的功能,常需要在细胞和个体中对基因进行方向相反的两个操作,即提高基因表达水平(上调)和降低基因表达水平(下调)。与个体水平的基因操作技术相比,在细胞水平很容易对目的基因的表达水平进行控制。
熟练掌握基因的克隆技术是进行基因表达上调和下调研究的前提。基因克隆,通常指cDNA克隆(cDNA cloning), 即将mRNA逆转录形成的cDNA或通过体外聚合酶链式反应得到的基因片段,插入到能进行自我复制的载体(通常是质粒,plasmid),实现在受体细菌内大量扩增的过程。克隆过程中用到的载体被称为克隆载体(cloning vector)。为开展基因表达的上调和下调研究,需要借助适当的 限制性核酸内切酶(restriction nuclease), 从含有目的基因片段的克隆载体中酶解出目的基因DNA, 转移到能够启动目的基因表达的表达载体(expression vector, 通常是质粒或病毒载体)中。
蛋白质相互作用的研究技术
蛋白质是细胞功能的主要执行者。在许多情况下,一个细胞功能的实现是多个蛋白质分子相互作用的结果。细胞的生命活动,如细胞的信号转导、基因转录、蛋白转运、蛋白质修饰和降解等,都依赖于蛋白质之间的相互作用。研究蛋白质相互作用是理解细胞生命过程的关键。实验室中常用的蛋白质相互作用研究技术包括免疫沉淀、酵母双杂交等方法。
蛋白质与核酸相互作用的研究技术
蛋白质与核酸(DNA和RNA)的相互作用是基因表达调控的基础。基因表达调控是细胞对外部或内部刺激发生应答的方式,可以发生在转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平。转录水平的调控涉及基因组DNA与一系列结合蛋白的相互作用,也就是多种转录因子与多个基因转录调控区域的特异性结合;而转录后水平和翻译水平的调控涉及多种RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)参与,也即多种RNA分子与多种RBP之间的特异结合,以完成RNA加工、修饰、转运、定位和降解等过程。掌握DNA与蛋白质、RNA与蛋白质相互作用的研究方法,对深入研究基因表达调控的分子机制有重要帮助。随着基因组学、生物信息学和测序技术的进步,我们已经可以在全基因组水平对细胞的基因表达调控进行分析。