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🐞 FLP/FRT 系统
- 位点特异性重组（site-specific recombination）：主要是通过借助能够识别特异性位点的重组酶（site-specific recombinase，SSR），在基因组上对外源 DNA 进行操作，可以实现基因的置换、倒置和删除等。FLP/FRT 系统就属于位点特异性重组系统的一种。
- FLP是一个重组酶（flippase，Flp），类似于Cre，它识别的位点是FRT，当FRT在同一条DNA上且方向相同时，则两FRT位点之间的基因则被删除；FRT方向相反，则基因被倒转。
- FRT：short flippase recognition target (FRT)
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🐞 Dre（D6特异性重组酶）
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🐞 Cre-loxP
概述
Cre是重组酶（38kDa），可识别 34bp 长的 DNA 序列 loxP（重组酶识别的位点）【Cre酶的基因序列来源于P1噬菌体的环化重组酶（cyclization recombinase）】。
locus of X-over P1来源于噬菌体P1，是一段长度为34bp的DNA序列，包括两个13bp的反向重复序列和一个不对称的8bp间隔区组成。反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向。
loxP 两侧各 13bp 构成回文结构，中间 8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性
ATAACTTCGTATA - NNNTANNN -TATACGAAGTTAT（N 表示碱基可能发生变化）
Cre重组酶识别loxP位点两端的反向重复序列并结合形成二聚体，然后此二聚体与另一个loxP位点上的二聚体结合形成一个四聚体。LoxP位点是有方向性的，四聚体连接的两个位点在方向上是平行的。然后两个loxP位点间的DNA序列被Cre重组酶切断。接着，DNA连接酶快速高效地将这些链连接起来。重组的结果取决于loxP位点的位置和方向。
- **反转：**如果 loxP 站点位于相同的 DNA 链上，并且方向相反，则重组会导致反转，并且 loxP 站点之间的 DNA 区域发生逆转。
- **删除：**如果站点朝同一方向，则 loxP 站点之间的序列将作为圆形 DNA 片段切除（并且不保持）。
- **迁移：**如果这些位点位于单独的DNA分子上，则在 loxP 站点生成转移事件。
三种情况也有可能会发生逆转，可以通过引入两对不同的loxP位点，经过两组loxP位点的两轮重组即可达到一种稳定状态。在基因编辑动物中，最常用的是A、B两种情况，这两种基因编辑方式也可以简单的概括为“正向删除，反向反转”
潜在弊病、解决方案
测试 新的Cre小鼠品系
Cre-containing Plasmids（质粒）
早期Cre小鼠的建立主要通过随机转基因的方式，将外源特异性启动子连同Cre基因序列随机地整合到小鼠基因组中。
更为可靠的方法是通过**基因打靶（ES细胞同源重组 或 CRISPR/Cas9途径）**的方式将单拷贝的Cre基因定点整合到内源基因座中，受内源基因表达调控。一般有以下3种做法：
Cre表达框直接插入到内源基因起始密码子前；
- Cre连接在2A自剪切序列之后，插入到内源基因终止密码子位置；
Cre连接在内部核糖体进入位点（IRES）之后，插入到内源基因终止密码子之后。
- Inducible Cre: 诱导型 Cre：需要添加外源性配体（例如他莫昔芬）激活；严格的时间调节
- Promoter-regulated Cre: 启动子调节的 Cre：启动子区域定义了 Cre 表达的区域
- Fluorescent Cre: 荧光 Cre：实现 Cre 表达的可视化
- Optimized Cre: 优化Cre:cre表达被调控、cre酶被替代
- Split Cre: 分裂cre：cre酶的组合受多个启动子调控
LoxP (floxed) Constructs
LoxP放在目的基因的内含子中（中间是外显子，最好是功能区外显子）
These constructs allow for Cre-regulated gene expression. Depending on the construct, Cre may activate or repress gene expression. Common construct types include:
- Cre-dependent Gene Expression: Cre依赖性的基因表达：上游 + 在不存在 Cre 的情况下阻止基因表达
- Cre-dependent Gene Knockout: Cre依赖性的基因敲除：允许基因表达直到 Cre出现
- Cre-dependent shRNA Expression: Cre 依赖性 shRNA 表达：Cre-lox 可用于打开或关闭 shRNA 构建体
- Gene Switch: 基因开关：Cre 表达切除基因 A 并改变阅读框以允许基因 B 的框内翻译
- FLEx Switch: FLEx 开关系统：利用了 Cre 的方向特异性和不同类型的可用目标位点，控制基因目标位点的数量、方向、类型
- Application: 嵌合体标记与追踪系统【MADM Strategy】
- [ ] Tip: 条件性基因敲除应避免Cre和flox位于同源染色体 ——- Cre和flox若在同一条染色体，在不考虑概率极低的在适当位置发生染色体同源重组的情况时，将无法得到Cre阳性且flox纯合的子代，也就不能实现flox目标基因纯合敲除，会干扰基因功能分析。
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