RNA免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀
<aside> 💡 ChIP【染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation）】
在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
用来研究细胞内DNA与蛋白质相互作用，具体来说就是确定特定蛋白（如转录因子）是否结合特定基因组区域（如启动子或其它DNA结合位点）——可能定义顺反组。ChIP还被用来确定基因组上与组蛋白修饰相关的特定位点（即组蛋白修饰酶类的靶标）
[ ] 优点：能在体内捕获转录因子和靶基因的相互作用，能同时快速地提供一种或者多种基因的调控机制；提供了研究DNA-蛋白质结合的有力工具，可发现新的参与基因调控的转录因子
[ ] 局限性：
需要抗目的蛋白或者特殊修饰标签的高度特异性抗体
假阴性信号可能源于无效的抗体结合或者在交联过程中抗原受到干扰
甲醛固定可能是暂时的，甚至是非特异的，可能导致相邻的蛋白形成假阳性信号
难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息
[ ] 应用
检测体内反式因子与DNA的动态作用
研究组蛋白的各种共价修饰与其基因表达的关系
</aside>
流程
- 第一步：将蛋白交联到DNA上。 也就是保证蛋白和DNA能够结合，找到互作位点
- 第二步： 通过超声波剪切DNA链
- 第三步： 加上附上抗体的磁珠用于免疫沉淀靶蛋白。抗体很重要
- 第四步： 解除蛋白交联；纯化DNA
![LQS_K}GX1ON]6BH8H0${PH7.jpg](https://s3-us-west-2.amazonaws.com/secure.notion-static.com/ed0fb586-1254-47bb-882e-24c728ead703/LQS_KGX1ON6BH8H0PH7.jpg)
Problems with Chip-seq
| 。 | ChIP-Seq | CUT&RUN | CUT&Tag |
|---|
| 是否需要固定 | 需要 | 不需要 | 不需要 | | 染色质片段化方法 | 超声打断 | MNase消化 | 基于Tn5的打断 | | 所需细胞数量 | 100-1000万 | 50万 | 0.5-50万 | | 所需测序深度* | 20-50M reads | 8M reads | 2M reads | | 是否整合建库过程 | 否，需要另外的建库步骤 | 否，需要另外的建库步骤 | 是，通过片段化加接头 | | 适用的靶点 | 广泛适用于组蛋白修饰、转录因子和辅因子 | 广泛适用于组蛋白修饰、转录因子和辅因子 | 主要适用于组蛋白修饰，少许转录因子和辅因子 |
Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease（靶区裂解和核酸酶释放）步骤
- 用凝集素涂层的磁珠从组织或细胞培养物中分离出细胞核
- 孵育一抗
- MNase消化：加入融合MNase的蛋白A，加Ca*激活
- 解交联：片段通过37°C的短孵育从细胞核中释放出来
CUT&RUN doesn’t require fixation and significantly decreases background noise, reducing the read depth necessary when sequencing and lowering the amount of tissue needed per experiment.
using the DNA cutting activity of a Protein A fused micrococcal nuclease (MNase) to specifically isolate DNA that is bound by a protein of interest
（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）免去了甲醛交联、超声破碎和免疫共沉淀的过程，这样既节省了初始实验材料又提高了信噪比、提升了实验重复性
Tn5转座酶两端已装载好建库接头引物，Tn5是一种镁离子依赖酶**