| 是否需要固定 | 需要 | 不需要 | 不需要 | | 染色质片段化方法 | 超声打断 | MNase消化 | 基于Tn5的打断 | | 所需细胞数量 | 100-1000万 | 50万 | 0.5-50万 | | 所需测序深度* | 20-50M reads | 8M reads | 2M reads | | 是否整合建库过程 | 否，需要另外的建库步骤 | 否，需要另外的建库步骤 | 是，通过片段化加接头 | | 适用的靶点 | 广泛适用于组蛋白修饰、转录因子和辅因子 | 广泛适用于组蛋白修饰、转录因子和辅因子 | 主要适用于组蛋白修饰，少许转录因子和辅因子 |

**ChIP【染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation）】**被用来研究细胞内DNA与蛋白质相互作用，具体来说就是确定特定蛋白（如转录因子）是否结合特定基因组区域（如启动子或其它DNA结合位点）——可能定义顺反组。ChIP还被用来确定基因组上与组蛋白修饰相关的特定位点（即组蛋白修饰酶类的靶标）

流程

1. 第一步：将蛋白交联到DNA上。 也就是保证蛋白和DNA能够结合，找到互作位点
2. 第二步： 通过超声波剪切DNA链
3. 第三步： 加上附上抗体的磁珠用于免疫沉淀靶蛋白。抗体很重要
4. 第四步： 解除蛋白交联；纯化DNA

![LQS_K}GX1ON]6BH8H0${PH7.jpg](https://s3-us-west-2.amazonaws.com/secure.notion-static.com/ed0fb586-1254-47bb-882e-24c728ead703/LQS_KGX1ON6BH8H0PH7.jpg)

Problems with Chip-seq

• require a large amount of input material, cells or tissue, to produce a strong enough signal over background noise
• require cross-linking during an initial fixation step

⬆️ CUT & RUN Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease（靶区裂解和核酸酶释放）

步骤

1. 用凝集素涂层的磁珠从组织或细胞培养物中分离出细胞核
2. 孵育一抗
3. MNase消化：加入融合MNase的蛋白A，加Ca*激活
4. 解交联：片段通过37°C的短孵育从细胞核中释放出来

纯化DNA，加衔接子adaptor，PCR扩增建库

CUT&RUN doesn’t require fixation and significantly decreases background noise, reducing the read depth necessary when sequencing and lowering the amount of tissue needed per experiment.

using the DNA cutting activity of a Protein A fused micrococcal nuclease (MNase) to specifically isolate DNA that is bound by a protein of interest

• 毛地黄皂苷 Digitonin
• 刀豆球蛋白 A 珠子
• 逆转固定细胞或组织样品中的交联
• detail

⬆️ CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）

• 细胞首先被通透化，并与固定在伴刀豆凝集素A （ConA ）涂层磁珠上的抗体一起孵育。该磁珠抗体可便于后续的清洗步骤
• 特异性抗体和靶标蛋白孵育结合
• 加入Tn5转座酶-Protein A复合物，其中**Tn5转座酶两端已装载好建库接头引物，Tn5是一种镁离子依赖酶**
• 特异性抗体和Protein A相结合，转座酶Tn5被“拉”到转录因子附近
• 转座酶Tn5一次性完成附近DNA打断并完成NGS加接头过程，可直接建库。

免去了甲醛交联、超声破碎和免疫共沉淀的过程，这样既节省了初始实验材料又提高了信噪比、提升了实验重复性

基于CUT&Tag，单细胞转录因子结合位点的研究也成为可能，这也展示了CUT-Tag的潜能