Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering_review_ Zhang et al Cell.pdf

5' tracrRNA+Cas9+Cas1, Cas2, Csn2+引导序列+**CRISPR [重复序列、间隔序列**crRNA**]**

pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）也转录出来， 并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。

作用机制

第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得（俘获外源DNA，登记“黑名单”）

• CRISPR/Cas系统将识别出入侵者的“名字”（PAM “靶标顺式共识序列” Protospacer Adjacent Motif）并找到它的“身份证”（原间隔序列），然后把入侵者身份信息作为“档案”（高度可变的间隔序列）记录到“黑名单”（CRISPR序列）
• 原间隔序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，被称为原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基）。PAM序列的存在使得CRISPR-Cas系统能够区分靶标DNA与宿主基因组中的DNA，确保系统只切割目标DNA而不影响宿主基因组。
• 病毒入侵时，Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描这段外源DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原间隔序列。随后，Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。然后，DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。
• 外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5' 到3' 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。

第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）

• CRISPR/Cas系统共有三种方式（Type Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）来制造”军火“。CRISPR/Cas9系统属于Type Ⅱ，是目前最成熟也是应用最广的类型。
• tracrRNA是由重复序列区转录而成的具有发卡结构的RNA，而pre-crRNA是由整个CRISPR序列转录而成的大型RNA分子。
• CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（crRNA的前体），同时与pre-crRNA序列互补的**tracrRNA（反式激活crRNA）**也被转录出来。
• pre-crRNA，tracrRNA以及Cas9编码的蛋白将会组装成一个小型“兵工厂”。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证”（间隔序列RNA），并在**核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）**的协助下对这段间“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区）。crRNA，Cas9以及tracrRNA组成 crRNA-tracrRNA-Cas9复合物，就是最终的“战斗武器”。

第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰）

• 这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop结构（由一条RNA与DNA杂合链和一条单链DNA所组成，类似于转录过程中的结构）。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。
• 随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物，其HNH酶活性将剪切crRNA互补的DNA链，而其RuvC活性位点将剪切非互补链。
• 最终，Cas9强大的火力使双链断裂（DSB）形成，外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。

应用

tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。

CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。

CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸内切酶，用于复杂基因组的编辑，目前该技术应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠及细菌等的基因组精确修饰

基因敲除（Knock-out）

基因敲入（Knock-in）

基因抑制、基因激活（Repression or Activation）

多重编辑（Multiplex Editing）

功能基因组筛选

• 在向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA将被看作病毒或外源DNA，被精确剪切
• 限制条件：待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）；向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。

<aside> 🍁 缺点：脱靶

脱靶：CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10-12bp碱基的配对，而其余远离PAM处8- 10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不大。

张峰和Jeffry D Sander:在基因组的其他位置即使有某一个、连续两个或三个碱基与靶位点不同，gRNA也可以引导Cas9去切割，进而造成脱靶。限制了我们的应用。

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