将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。