差速离心

利用不同的离心速度所产生的不同离心力,将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开

差速离心法(differential centrifugation)是分离细胞核、线粒体等亚细胞结构常用的方法。在密度均一的介质中,颗粒沉降速度与其直径成正比,颗粒越大沉降越快。低速离心时,大的组分如细胞核和没破坏的细胞很快沉降,在离心管底部形成小的沉降团块;在较高速度时,线粒体沉降成块;在更高速度加长时间离心,可以先收集封闭小泡,然后收集核糖体。

由于离心沉降前,各种颗粒在介质中是均匀分布的,因而某些慢沉降颗粒被裹到快沉降颗粒的沉降块中,如此分级分离所得到的分离组分纯度不高,再次悬浮小沉降块中的组分,反复离心可去掉杂质而纯化。

应用物理的方法,在等渗缓冲液中裂解细胞,离心后获得的细胞匀浆中含有膜性结构完整的细胞器。这些细胞器的表面分布有特异性的蛋白,如位于线粒体外膜参与蛋白转运的TOMM22,过氧化物酶体表面参与蛋白转运的PM70。利用能够识别这些标志的磁珠(magnetic beads), 无需高速离心,即可将膜性细胞器从细胞匀浆中方便地分离出来。

用100 OOOg将细胞匀浆超速离心,可以将各种细胞器及微粒体沉降下来,上清部分即包含分布于细胞内细胞器之间的液相成分,即细胞质溶胶(cytosol)。细胞质溶胶是细胞内蛋白质合成及其他主要生化反应的场所,含有RNA及大量的蛋白。

Untitled