柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，会使与柠檬酸合成有关的各种酶的活性受到抑制或阻遏

• [ ] 三个控制点

  

磷酸果糖激酶(PFK)活性的调节

• [ ] 柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶（调节酶）有抑制作用

• [ ] AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用

  由于Mn+的缺乏，菌体的TCA酶活下降；干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解，使得微生物体内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成柠檬酸。

  • Mn+ 缺乏如何会使NH4+浓度升高呢

能荷调节对柠檬酸发酵的影响

菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止

如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。

柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP

• 该菌体内存在 侧系呼吸链 —— 氧化柠檬酸大量积累时所产生的 NADH，正常的传递H+给O2，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，保证 EMP 的畅通【缺氧- - 不可逆失活】
• 能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链

回补途径 —— 保证草酰乙酸的供应

☆TCA循环重要功能除产能外，还为一些氨基酸和其它化合物的合成提供了中间产物；

☆生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，循环就会中断；

☆回补方式：

• 通过某些化合物的CO2固定反应
• 一些转氨基酶所催化的反应也能合成草酰乙酸和a-酮戊二酸
• 通过乙醛酸循环

顺乌头酸酶活性的控制

该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。

• 铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁，可以提高柠檬酸产率。因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢反应器，目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。柠檬酸发酵过程中，培养基中Fe2+的浓度又要求不能够低于0.1mg/L，原因尚没有搞清楚。
• 随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。
• 添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累
• 采取育种手段改造菌种阻断TCA环，积累柠檬酸

<aside> ⭕ 总结

1. 由于Mn2＋缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4＋浓度升高和有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通；
2. 由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。
3. 顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸＝90∶3∶7；
4. 控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，使柠檬酸积累；
5. 柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。 </aside>