<aside> 🍁 噬菌体

是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下，上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞、自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增

根据病毒感染的宿主范围可将病毒分为：动物病毒、植物病毒、细菌病毒(噬菌体)

• 结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）/单链RNA（少数） </aside>

<aside> 🍁 噬菌体的生活周期

• 溶菌周期：烈性噬菌体（virulent phage)
• 溶原周期：温和噬菌体（temperate phage) </aside>

单链噬菌体载体

单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：M13、f1、fd 噬菌体

M13噬菌体

丝状噬菌体、+DNA（SSDNA )

复制型（RF)是双链环状DNA。

单链DNA和双链DNA都能转染感受态大肠杆菌，并产生噬菌斑。不存在包装限制。

可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。

<aside> 🍁 噬菌粒载体（phagemid vectors）

• 由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列

特点

• 分子量小
• 克隆能力大
• 两种复制形式

• [ ] 常见的噬菌粒载体

  噬菌粒载体	质粒部分	单链噬菌体部分	辅助噬菌体	大肠杆菌寄主
  pEMBL8	pUC8	f1	IR1	71/18
  pRSA101	πVX	M13	M13变异株	XS127，XS101
  pUC118/pUC119	pUC18/
  pUC19	M13	M13K07	MV1184
  pBS	pUC	f1	M13K07	XL1-Blue

  辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体

  • pUC118/pUC119
  • pBluescript 噬菌粒载体（pBS）
  • PCR产物克隆载体- - - - T-载体 </aside>

双链噬菌体载体—λ载体

• λDNA分子的特点：长度为48502 bp、双链线性DNA、两端有cos位点，可以环化

• [ ] λ噬菌体的基因组特点

  λDNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）

<aside> 🍁 λ噬菌体载体的构建

选用λ噬菌体作为构建克隆载体材料的依据

λ噬菌体是一种温和噬菌体 能承载比较大的外源DNA片段 有多种限制性核酸内切酶识别位点

野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体

1. 野生型λ噬菌体的DNA分子量大，且其中含有较大的非必须区段
2. 具有较多的酶切位点【λ噬菌体DNA上本身有5个 EcoR I 和7 个Hind III切点】。这些酶切位点可能位于与噬菌体生长繁殖有关的区域，用限制酶切割后会影响噬菌体的增殖
3. 无选择标记，不利于后续重组分子的筛选
4. 具有感染性，需要对相关基因进行改造才能成为安全载体

• 构建原理：删除λ噬菌体的非必需区，留出插入空间

• 构建过程

• 人工构建的λ噬菌体载体有两种类型

  • 插入型载体（insertion vectors)：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点
  • 替换型载体（substitution vectors)：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代

• λ载体的筛选标记

  • 置换型载体：可取代片断中如果包含LacZ’，可用Xgal显色作筛选标记
  • 插入型载体：根据插入所引起的表型突变

• λ载体的体外包装

  λDNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低；必须利用噬菌体外壳的作用

  • 体外包装
  • [ ] 体外包装存在的问题
    • 包装错误：既能包装用于生产头部蛋白的内源性原λDNA，也能包装重组的λDNA载体
    • 重组：外源的重组λDNA载体被诱发与内源性原λDNA发生重组
    • 体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的75%—105% （36—51kb）之间 </aside>

• [ ] 考斯质粒载体的特点

  能像λ-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞

  能像质粒那样在受体细胞中自主复制

  重组操作简便，筛选容易

  装载量大(45kb) 且克隆片段具有一定的大小范围

  不能体内包装，不裂解受体细胞