分离纯化细胞中某种特定的蛋白质最常用的方法是柱层析(column chromatography)。可以将细胞匀浆或经过盐析、有机溶剂沉淀等处理的样品在常压或高压下，通过用固体性颗粒充填形成的柱，不同的蛋白质因与颗粒相互作用的不同而被不同程度地滞留。当它们从柱的底部流出时，可被分别收集。

根据所选择的充填颗粒的不同，常用的柱层析可以分为：

①离子交换层析，充填颗粒带有正电或负电，蛋白质按其表面电荷的分布而被分离；

②凝胶过滤层析，充填颗粒为多孔性的凝胶颗粒，根据蛋白质的大小将其分离；

③疏水性层析，将疏水性基团共价结合在充填颗粒上，不同蛋白质表面疏水区域会有强弱的差异，流出柱的速度也不同；

④亲和层析，把能够与蛋白质表面的特定部位进行特异性结合的分子共价连接于惰性多糖类颗粒上，如酶的底物、特异性抗体或抗原，根据蛋白质亲和性的不同将其分离。亲和层析分离纯化重组蛋白为最常用的方法。

值得强调的是，由于蛋白质的结构、理化性质的复杂多样性，除了带有特殊标签的人工表达蛋白质以外，很难找到针对某种特定蛋白质的特异性亲和层析法。

因此，大部分蛋白质的分离纯化需要多种方法，包括多种柱层析法的组合，才能够达到目的。普通柱层析法由于充填颗粒的不均匀等因素，使通过柱的液相流量不均，导致分离能力下降。高压液相层析是将直径在3～lOµm之间的微小球型树脂（通常为硅胶树脂）用特殊的装置均匀充填在层析柱中。由于颗粒小充填紧密，必须加高压才能使液相流过。高压液相层析所用层析柱多为不锈钢柱，分离时间短、效率高，可用来分析各种大小分子，但所需仪器精密，造价高。

各种层析方法包括高压液相层析，多可以维持蛋白质不发生变性，保待蛋白原有的功能。但高压液相层析的反向层析柱常常被用来分离小分子蛋白、用酶或化学试剂切断的蛋白质的多肽混合物，根据多肽亲疏水性特点，流动相采用梯度有机溶剂。