• [ ] 先了解质粒的基本组成元素——Ori复制起始点、抗性基因有哪些、多克隆位点在哪里，有哪些酶切位点？有哪些荧光标记或蛋白标签序列?

  对于一个质粒，首先要确定它的性质和类型——据Ori来了解质粒的类型：原核、真核、穿梭质粒、慢病毒、腺病毒的载体。

  • Ori
  • Ori序列特点

• [ ] 看质粒是否是表达载体【启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号】
• U6 promoter
• CBV promoter
• SV40 NLS
• bGH（Bovine growth hormone）poly(A) signal

• [ ] 弄清楚方向。最重要的是要弄清楚目的基因插入那一段（从T7启动子到终止子那一段）的方向，即下图黄色圈圈所示的箭头方向，其它的可略。

• 逆转录病毒质粒的示意例图

• 筛选标记:

• 多克隆位点(MCS):

• Gateway cloning

• 功能元件:

• 荧光

• [ ] 灵活使用操纵子结构

  secY是一种转运膜蛋白，其功能的缺失会导致细菌无法正常生长。看图可知启动子的表达方向与secY基因表达的方向相反，因此表达出一个secY反义mRNA，从而沉默细菌转录出的secY mRNA，无法得到有功能的SecY膜蛋白。

  tetR为一种阻遏蛋白基因，其诱导物为四环素，当在培养基中加入合适浓度的四环素，四环素使tetR阻遏蛋白失活而起始反义secY的表达，使得含有该质粒的细菌死亡，从而达到筛选的目的。

图为一个敲除载体，黄框内为反义secY表达盒，运用了负调控诱导系统的原理。

Pxyl/tetO为启动子