获取RNA的一般方法：

Poly（T）探针和mRNA上的Poly(A)尾巴，用磁珠来回收这些吸附在探针上的、带poly(A)尾巴的mRNA，把mRNA洗脱下来，建库——对总RNA质量的要求非常高（一般会要求总RNA的RIN值在8.0以上），如果总RNA有一定程度的降解，那么Poly(T)探针所能吸附到的，都是靠近mRNA的3’端的那些片段而mRNA的5’端的那些断片，就会大部分地被丢失——测序得到的结果就会有很大的偏向性。

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RiboZero方法

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设计吸附核糖体RNA的探针，用探针来吸附核糖体RNA。

再用带链霉亲合素的磁珠来吸附这些带生物素标记的探针。

最后磁珠被磁铁吸附在管壁上。

而其它的RNA，包括mRNA、LncRNA、和small RNA等RNA则留在上清液当中。

优势

  1. RiboZero 降低了对 RNA 样本的质量要求。部分降解的，甚至严重降解的 RNA 都可以用 RiboZero 的方法去除核糖体 RNA，后进行建库测序。

    最典型的是从石蜡样本中回收的 RNA 样本，因为从石蜡样本中回收的 RNA 样本，质量非常差，难以直接进行测序。现在有了 RiboZero 方法，就可以很方便地建库测序。

  2. 能对不带 Poly(A)尾巴的 LncRNA 进行测序。目前成熟的大部分 LncRNA 测序方案，都是通过 RiboZero 的方法，去除核糖体，接下来再进行建库。

限制

由于每个物种 rRNA 序列有所差异，每种 RiboZero 的试剂盒其中的探针序列，都是有物种特异性的。EpiCentre 公司开发了多个针对不同物种的 RiboZero Kit。其中最常用的是针对：人、小鼠、大鼠的试剂盒。所以，科研客户在请测序公司进行 RiboZero 方法的建库测序的时候，需要和测序公司确认所测的物种信息。当然，对于任何的测序都应清楚其样本来源。

定向 RNA 建库

Truseq RNA 测序方案的另一个问题就是，它两端所加 Y 型接头的方向是对称的。所以测完序后，我们无法知道测出来的序列的方向性。也就是说，无法知道测到的是 RNA 的正义链，还是反义链。

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如果我们测的是人、小鼠之类的样本，那么问题不是很大。因为这些模式生物基因组序列、转录本序列，都是比较清楚的。但是，如果们是在测一些新的物种的时候，那么我们就不知道测到的是正义链还是反义链了。为了解决这个问题，科学家设计了多种方向性文库的建库方法。今天，我们就为大家介绍其中两种方向性文库的建库方法。

1. 掺 U 法

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原理：用掺入 U 碱基的办法，来标识 cDNA 的第二条链。

  1. 用常规方法，从 RNA 上转录出第一链 cDNA。
  2. 合成第二链时，用 dUTP 来代替了 dTTP。用这样的 dNTP 来合成出的第二链，当中就掺入了大量的 U 碱基，而之前的第一链，是没有U碱基的。这样，第一链和第二链就有了差别。
  3. 在双链 cDNA 的两端接上 Y 型的接头，并用 USER 酶进行消化（cDNA的第二链被降解掉）
  4. PCR 扩增。降解过后，文库只剩下第一链，而这条链的两头是接的不同序列的接头，那么扩增出来的文库，就能出现双个不对称的接头序列。这时测序的结果就会是有方向性的文库。

🔎「USER 酶(Uracil-Specific Excision Reagent)」分别从 E. coli K-12 菌株纯化出 Endo VIII 和尿嘧啶 DNA 糖基化酶(UDG)的混合酶。UDG 能够识别 DNA 链中的 U 碱基，并且把 U 碱基进行糖基化。再把这个糖基化的 U 碱基从核酸链上切掉，同时保持磷酸二酯骨架完整。这样核酸链上就形成了一个缺碱基的空位。接着，Endo VIII 就在脱碱基位点上把磷酸二酯键切断，释放无碱基的脱氧核糖。USER 酶在此处作用的结果是将 cDNA 的第二链降解。

2. ScriptSeq

原理：在加接头时直接使用两种不同的接头。

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  1. 合成第一链 cDNA 时，右侧引物是 5'端带标签 A 的接头序列。

    延伸出的 cDNA 链 5'端，自然也就带上了 A 接头序列。

  2. 加入特殊引物 TTO。TTO 的 5'端带有标签 B——结果是将带标签 B 的接头加到了 cDNA 链上。

  3. 再用外侧的 PCR 引物对其进行扩增。这对外侧的引物各带有一段与标签互补的序列和带一段与测序芯片上的接头互补的序列（绿、紫色）。这样扩增得到的产物，就是正式的文库了。

🔎「TTO(Termianl-Tagging Oligo)」顾名思义，这是一种带标签的引物。而终止的含义在于，其 3'端最后一个碱基是双脱氧核苷酸，能阻止 DNA 聚合反应。双脱氧核苷酸前面是一段随机序列，能使引物与刚合成的第一链 cDNA 进行杂交。

同样，由于这个文库的左右带不同的标签，所以这个文库测出来就是有方向性的，从而得到方向性的文库。