<aside> 🍁 先导编辑器系统（Prime Editor，PE ）

• 是一种最新的基因组编辑技术，可以在不引入双链断裂（DSB）和供体DNA模板的前提下，实现靶标位点的插入，缺失和所有12种类型点突变（目前ABE和CBE系统仅能实现C→T,G→A,A→G, T→C四种突变类型）。主要的编辑器是Cas9切口酶域（灭活的HNH核酸酶）和工程逆转录酶域之间的融合蛋白。
• 这一套基因编辑系统被命名为PE。而且在改进的过程中，诞生了PE1、PE2和PE3，三代编辑工具。其中PE1和PE2只能切开一条DNA链，PE3在PE2的基础上加了一份sgRNA，可以切断非编辑链，提高了编辑效率
• 虽然先导编辑器的效果令人惊喜，但仍有许多待解决的问题，例如细胞状态/类型对编辑效率的影响，先导编辑过程中涉及的DNA修复机制等。同时探寻适用于先导编辑的小型逆转录酶对于其未来应用相当关键。 </aside>

Prime editing不会产生DNA双链断裂，不需要供体DNA

Prime editing需要设计一种特殊的gRNA，也就是pegRNA。与普通的gRNA不同，这种pegRNA不但能结合想要进行编辑的特定DNA区域，还自带“修改模板”。

Cas9-逆转录酶融合蛋白会在pegRNA的引导下，精准地切开一条DNA链，然后根据“修改模板”，合成含有正确序列的DNA。细胞内的DNA修复机制会自动把这段新合成的序列整合进基因组。

Prime editing系统由两部分构成

• nCas9 (H840A)与工程化改造的逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）融合构成的效应蛋白
• pegRNA（Prime Editing Guide RNA），包括了single-guide RNA（sgRNA）、引物结合位点（Prime Binding Site，PBS）和储存有靶向位点编辑信息的反转录模板（RT templet with edit）

工作原理

• [ ] 一方面**对Cas蛋白进行了修改，让其只能切断DNA双链中的一条链。另一方面，在向导RNA上接上了一段要添加的DNA的模板RNA**，**成为编辑扩展向导RNA (pegRNA)**，相应的在Cas上加上了一个逆转录酶(利用模板RNA逆转录出来的DNA去修复目标位点）

• nCas9 (H840A)切口酶在pegRNA上的sgRNA序列指引下，切割DNA单链

  为什么一定要在PAM识别链上进行单链切割：因为这样切割后，会在这条单链DNA上形成3′末端（3′ flaps）和5′末端（5′ flaps）两段序列，而5′末端会被具有5'核酸内切酶和5'核酸外切酶活性FEN1和具有5'核酸外切酶活性的EXO1蛋白切割。而3′末端通过反转录酶合成的编辑序列，就可以更大概率的保留在修复后的序列中。通过这套系统，可以在无需引入双链断裂和外源DNA模板的情况下，有效地产生精确的碱基转换或颠换，插入和缺失等变异。

• pegRNA 3′-端的PBS（引物结合序列）与切割断点前的互补序列识别配对

• 逆转录酶（M-MLV RT）以pegRNA上PBS序列后的人工设计的模板序列为模板进行逆转录，将目标序列直接聚合到切口的DNA链上。

• 反应结束后DNA链的切口处会形成处在动态平衡中的5'-和3'-flap结构，其中3'-flap的DNA链携带有目标突变，而5'-flap结构的DNA链则无任何突变。细胞内5'-flap结构易被结构特异性内切酶识别并切除，之后经DNA连接和修复后靶位点处便实现了精准的基因编辑。

图 PE–pegRNA复合物结合目标DNA位点，并切割含PAM序列的单链

由于PE2编辑后的DNA双链为杂合链，即一条为编辑链，一条为非编辑链。而杂合双链错配修复的模板是随机的，为了解决因错配修复造成的编辑效率降低，他们团队进一步开发出了PE3版本编辑系统，这一版本在非编辑链上距离pegRNA造成的切口处50bp的位置引入了一个新的切口（避免产生双链断裂），从而让细胞尽量多的以编辑链为模板进行DNA修复）。这种方法可以进一步将编辑效率提高1.5-4.2倍，达到55%的编辑率。进一步地，在编辑链修复完成后，再切割非编辑链进行错配修复，理论上可以进一步降低DNA双链断裂的形成和非目标indel的产生。PE3b系统，将切割非编辑链的gRNA 靶向编辑链被编辑后的序列，这样非编辑链上的切口必须要在编辑链被编辑完成后才产生，于是就可以在保留 PE3 编辑效率的同时降低由 DSB修复造成的随机 indel。

图3 PE3系统示意图