• [ ] 酵母双杂交系统 Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 建立：90年代，纽约大学的S. Field等建立 —— 基于对真核生物调控转录起始过程的认识

• 作用：通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。应用于**真核基因表达调控，细胞粘合因子间的相互作用、信号转导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离**等研究。

• [ ] 特点：
  • 优点：灵敏度高，特异性较好，简洁性（无需制备抗体，纯化抗原），广泛性（不同亚细胞部位，不同功能的蛋白质），真实性（在活细胞进行且作用条件与作用力无需模拟）
  • 缺点：容易出现假阳性和假阴性，并非对所有蛋白适用（对蛋白质在细胞中的定位有要求；有时DNA-BD结构域，AD融合部分 不包括相互作用位点/破坏融合蛋白的正确折叠 -> 不能检测出他们的相互作用），毒性作用；诱饵蛋白质有自激活性质（删除这一部分，但应避免删除相互作用的结构域）；
    • 解决方案：双筛选系统

原理

• [ ] 结构域（Domain）合作：许多真核生物的转录激活因子通常具有两个可分开的、功能上也相互独立的结构域 —— DNA结合域（BD）、转录激活域（AD）。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域【实验发现：只要DNA binding domain（DNA-BD）与Active domain（AD）靠近就能够表现转录激活活性】。不同来源的激活因子的BD区与AD结合后则可特异地激活被BD结合的基因表达。

基于这个原理，人们将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用就会使AD与BD形成完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。

• [ ] 拆开 Domain：用重组DNA技术把转录因子的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力
• [ ] 重组Domain：用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接
• [ ] 观察报告基因表达：通过效应基因是否被激活来检查（在体内，蛋白A与蛋白B是否能结）

• 常用的报告基因有HIS3、URA3、LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的营养缺陷型。 双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因，有利于杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用系统中BD来源主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
• 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子 GAL4
• DU AL系统

• [ ] 酵母双杂交系统由三个部分组成：
  • 与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）
  • AD融合的蛋白表达载体，其表达的蛋白称靶蛋白（prey）
  • 带有一个或多个报告基因的宿主菌株

X基因和Y基因产物的相互结合，导致reporter gene表达。

Reporter gene表达就可说明X基因产物于Y基因产物能结合。

发展

• [ ] 酵母单杂交

  一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系

  省略BD-X蛋白质杂交体，采用DNA特定的序列取代DNA- Gal4结合位点

  靶DNA序列- - -捕获- - -蛋白质—— 识别特异性转录因子；研究参与转录抑制和DNA复制过程的蛋白

  1. 研究DNA-蛋白质之间是否存在相互作用
  2. 分离、编码结合于目的顺式调控元件或.其他短DNA结合位点蛋白的新基因
  3. 定位已证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域；准确定位与DNA结合的核苷酸序列

• [ ] 酵母三杂交

  荧光三杂交系统：鉴定蛋白质蛋白质复合体；蛋白质形成二聚体，是许多关键调控信号通路的基础

  

  

• [ ] 酵母反向杂交

  一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因