PCR技术的主要类型

[ ] 几个概念区分：

**随机引物：**随机六聚体非特异的引物。

**套嵌引物（nested primers)：**设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。

**简并引物：**需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物

“折腾引物”的PCR变形

<aside> 🍁 巢式PCR
- 先用一对引物对模板进行扩增，取出第一次PCR产物；再用另一对引物扩增第一次PCR产物 </aside>
<aside> 🍁 融合PCR
- 特点 </aside>
<aside> 🍁 重组PCR（recombinant PCR）
- 定义：使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。
- 原理：将突变碱基，插入或缺失片段，或一种物质的几个基因片段均设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。其产物将是一重组合的DNA。
- 应用：位点专一碱基置换，DNA片段的插入或缺失DNA片段的连接（如基因工程抗体) </aside>
<aside> 🍁 不对称PCR
- 用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序 技术关键：两个引物的浓度相差100倍 </aside>
<aside> 🍁 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）
- 用于扩增已知一端序列的目的 DNA【单侧特异引物PCR】。在未知序列一端加上一段 dG的尾巴，然后分别用多聚 dC 和已知的序列作为引物进行 PCR 扩增- - - 主要用于分析具有可变末端的 DNA 序列，Loh A-PCR对人外周血淋巴细胞变性进行了分析。 </aside>
<aside> 🍁 RACE技术（Rapid amplification of cDNA end，cDNA末端快速扩增技术）
- [ ] 由已知的一段cDNA片段，利用锚式PCR，快速扩增cDNA末端从而获得已知mRNA内一段小序列与3‘或5’的cDNA序列技术
  - 3′RACE
  - 5′RACE
- RACE的意义
- RACE技术的优点
- RACE技术的局限性 </aside>
“折腾程序”的PCR变形

<aside> 🍁 降落PC
- 特点 </aside>
<aside> 🍁

复合PCR（多重PCR (multiplex PCR) ）
- 定义：在同一PCR反应中，用多组引物同时扩增几个基因片段的技术- - - 多种病原微生物的同时检测/ 鉴定；病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定；多点突变性分子病的诊断
- 中途进退式PCR Drop-in Drop-out PCR：外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，同时在第一次PCR时采用较高的退火温度，而第二次PCR采用较低的退火温度
- 特点：高效性，系统性，经济简便性 </aside>
融合PCR延展

<aside> 🍁 反向PCR（reverse PCR）
- 扩增两个引物外侧的未知序列 技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子
应用：
- 基于PCR的定点突变：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
- 可对未知序列扩增后进行分析：如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆，扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 </aside>
PCR产物“标记” 并计数

<aside> 🍁 荧光定量PCR 【Real-time PCR（RT-PCR ）】
- 普通PCR技术
- 半定量PCR（Semi-quantitative PCR)
- 定量PCR
- 实时定量PCR技术：借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定**CT值**（样品到达域值水平所经历的循环数），从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。
- 注意区分：转录基因的表达，动物自身原有基因的表达- - → 转基因序列带有标签，可以设计特定引物进行分析 </aside>
- 数字PCR
在PCR反应体系上“拓展”
- 等温扩增
- MSP
<aside> 🍁 热启动PCR
- 特点 </aside>
<aside> 🍁 原位PCR
- 在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点
- 操作
- 优势和不足 </aside>
<aside> 🍁 反转录PCR【RT-PCR （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）】
- **扩增RNA模板。**如mRNA或RNA病毒 技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增【将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术】- - - - 克隆cDNA、检测RNA、合成cDNA探针、制备基因表达文库
- 反转录酶 </aside>
<aside> 🍁 差异显示PCR（DD RT-PCR）
mRNA differential display RT-PCR

它是将mRNA逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。每一种组织细胞（包括同一组织细胞经过不同的处理）都有其特异的RNA指纹图谱- - - 对组织特异性表达基因进行分离
- 3’端的锚定引物：Oligo(dT)引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）
- 5’端的随机引物：10 mer - - - 扩增cDNA第一链；cDNA第二链，并PCR
- 随机引物与锚定引物成对扩增
- 随机-锚定引物PCR的产物电泳比较 </aside>