电泳分离
蛋白分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷,故可在电场中发生移动。不同的蛋白分子所带电荷量不同,且分子大小也不同,故在电场中的泳动速度也不同,由此可彼此分离。
支持物:滤纸,醋酸纤维膜,聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖
[ ] 聚丙烯酰胺凝胶(PAG:polyacrylamide gel**):**
由丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂的作用下,聚合交联而成的
[ ] AP:过硫酸铵, 催化剂,促凝作用。
[ ] TEMED: N,N,N',N'-四甲基乙二胺,加速剂。(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2
在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。
<aside> ⛱️ 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
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<aside> 🛖 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
最常用的分析蛋白质的电泳方法,特别适用于蛋白质的纯度鉴定和分子量测定
SDS-PAGE技术是根据SDS能使蛋白质变性解聚成肽链并与肽链侧链以--定比例结合成SDS-肽链复合体(雪茄状),从而掩盖了肽链本身所带电荷(SDS带负电),并消除了蛋白质分子间的形状差异,再结合PAGE技术(根据分子的形状、电荷、分子量综合差异来分离不同分子的技术)来分离不同分子量蛋白质或测定定蛋白质分子量的实验技术。
仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
一般情况下,在被分析的蛋白质稳定的pH范围,凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用,但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。
常用的缓冲液 : Tris-甘氨酸系统
由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度,只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小,因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率——不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度
<aside> 🛖 浓缩胶
在浓缩胶中,其pH6.8环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压梯度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。
浓缩胶浓度5%,凝胶孔径较大,基本没有分子筛效应
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<aside> 🛖 分离胶
当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加pH 8.8,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
甘氨酸的等电点为5.97
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凝胶配制过程要迅速, 催化剂Ap 和 TEMED要在注胶前再加入。注胶过程要一次性完成,避免产生气泡