对于利用 CRISPR/Cas9 介导的 NHEJ 途径【非同源性末端接合（Non-homologous end joining， NHEJ）】获得的 KO 小鼠，情况有所不同，方案类似于转基因小鼠的繁育。

由于 NHEJ DNA修复的结果是随机发生的，所以每一只 KO Founder 小鼠、甚至一只 Founder 中每个细胞的基因型都可能是不同的。

因此，KO Founder 要与野生型小鼠（比如：C57BL/6J）交配，获得基因型明确的 F1子代 KO 杂合子（+/-）小鼠。随后，才能进行杂合子小鼠的相互交配。

• 不同的 KO Founder 之间不能相互交配。
• 不同的 KO Founder 的子代之间也不建议相互交配。

CRISPR/Cas9

限制条件：

待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）；

向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。