DNA聚合酶（DNA polymerase）

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常用的DNA聚合酶的特点

共同特点：5’→3’聚合活性，把dNTPs连续地加到引物的3’-OH端

主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同

DNA聚合酶	3’- >5’外切酶活性	5’- >3’外切酶活性	聚合速率	持续能力
大肠杆菌DNA聚合酶 I	低	有	中	低
Klenow fragment	低	无	中	低
T4 DNA聚合酶	高	无	中	低
T7 DNA聚合酶	高	无	快	高
化学修饰T7 DNA聚合酶	低	无	快	高
遗传修饰T7 DNA聚合酶	无	无	快	高
Taq DNA聚合酶	无	有	快	高
高保真酶(Pfu, Kod+)	有	无	中	高
逆转录酶	无	无	低	中

用途

切口平移法（nick translation）标记DNA

利用其5’- >3’核酸外切酶活性降解寡核苷酸作为合成cDNA第二链的引物

用于对DNA分子的3’隐蔽末端进行末端标记

大肠杆菌DNA聚合酶 1 经枯草杆菌蛋白酶处理，切去N端5’→3‘核酸外切酶活性，获得全长C端三分之二的大肽段（76KD），即Klenow酶【仍拥有5‘—>3’的DNA聚合酶活性和3‘—>5’的核酸外切酶活性，但失去了5’—>3‘的核酸外切酶活性】

用途

补平：由核酸内切酶产生的5’凸出末端

DNA3’末端标记：在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP

随机引物法标记探针

cDNA第二链的合成

[ ] T4 DNA酶的基本特性
- 从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化，由噬菌体基因43编码。
- 3’→5’的核酸外切酶活性（降解单链更快）、5’→3’的DNA聚合酶活性
- 在无dNTP时，可以从任何3 ’-OH端外切；在只有一种dNTP时，外切至该dNTP位置；在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。

用途

补平3‘隐蔽末端

切平：由核酸内切酶产生的3’粘性末端

DNA3’末端标记：标记末端（取代合成法）

[ ] 来源：从T 7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成

①T7基因5编码的大亚基：有5’- >3’聚合酶和3’ - >5’ 外切酶活性。 ②大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。
[ ] 特点：
- 持续合成能力强：一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。
- 3’ →5外切酶活性高：单链和双链都能降解
- 不受DNA二级结构的影响：其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍

用途

以大分子量DNA为模板的引物延伸反应

进行末端标记：取代合成法标记3’ 末端，与T4 DNA聚合酶相同

将3’或5’的突出末端变成平端：补平3’隐蔽末端;切平3’突出末端