发现

从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。

DNA复制一定有断口

作用

• [ ] DNA复制
  1. 以“冈崎片段”的形式先合成
  2. 在连接酶的作用下连成一条完整的DNA链
• [ ] DNA损伤修复

两种常用DNA连接酶

• [ ] 大肠杆菌DNA连接酶：分子量为75kD的单体蛋白质；只能连接黏性末端
• [ ] T4噬菌体的连接酶：分子量为60kD的单体蛋白质；不但能连接黏性末端，还能连接平齐末端

连接条件

• 必须是双链DNA
• DNA 3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）
• 需要能量：动物或噬菌体中ATP；大肠杆菌中NAD+
  • NAD: N指烟酰胺，A指腺嘌呤，D是二核苷酸

机制

• ATP（NAD+)提供激活的AMP
• ATP与DNA连接酶形成共价结合“连接酶-AMP"复合物，释放出焦磷酸PPi
• AMP与连接酶的赖氨酸ε-氨基相连
• AMP从连接酶的赖氨酸ε-氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成”DNA-腺苷酸"复合物
• 3'-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP

影响连接反应的因素

• DNA分子浓度

  DNA分子浓度特别低- - - DNA末端很难碰到一起、DNA末端连接效率低

  插入片段与载体浓度的比例：2~10：1- - - - 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。

• 反应温度、时间

  连接酶反应 最佳反应温度: 37°C【MBI公司的T4 ligase需要22 °C

  37°C下粘性末端的结合很不稳定，一般用4~16°C

  连接反应的时间一般30分钟就足以取得较好的连接效果

• DNA分子末端的形式

  粘性末端（5‘突出末端、3’突出末端）、平末端

  用同一种限制性核酸内切酶或同尾酶切割载体和外源DNA来产生相同的粘性末端；这样产生的粘性末端的载体分子容易自我连接，需要用 碱性磷酸酶 脱磷酸化处理载体分子，以防止载体分子自连

  不同的粘性末端转化为平末端

  1. 直接连接- - - 效率低
     • 增加连接酶的浓度
     • 增加DNA片段的浓度
     • 向连接反应体系中加入一价阳离子和低浓度聚乙二醇
  2. 把平末端转化成粘性末端
     • 同聚物加尾法
     • 衔接物(Linker)
     • DNA接头(adapter)连接法

• 连接缓冲液

  Tris-HCl (pH 7.4-7.8) - - - -保持pH值的稳定性

  MgCl2- - - - -激活连接酶反应

  二硫苏糖醇- - - - - 维持还原环境，稳定酶活性

  ATP- - - - -提供能量

  BSA- - - - -增加蛋白质的浓度，防止酶因体系中蛋白浓度过小而失活

• 酶的浓度

  平末端DNA分子 1-2单位

  粘性末端DNA片段 0.1个单位

应用

• direct ligation of PCR products : 将PCR产物了解到质粒中