三个难题

• 如何实现均匀扩增
• 全基因组覆盖问题
• 要有较高的扩增效率

**两种方法（**比较认可的）

MALBAC方法

MultipleAnnealing and Looping-Based Amplification Cycles。谢晓亮教授发明

这张图是MALBAC方法的示意图。

黑色的线条：基因组模板DNA，

红色的线条：扩增引物，扩增引物的5’端有27个碱基的通用序列，这些通用序列会作为未来的PCR通用扩增引物的结合序列。扩增引物的3’端有8个随机序列的碱基，这8个碱基可以随机地杂交到基因组DNA的互补序列上。

这些灰色的椭园是Phi 29 DNA聚合酶，Phi 29 DNA聚合酶有一个特点，它不仅可以生成新的DNA链，它还能把之前已经合成好的DNA链给解链开。再形成自己的新链，这个特点能够把每个循环所能合成的DNA新链的数量提高几倍、甚至几十倍、上百倍。

接下来，就是做5个MALBAC循环（线性扩增），请注意，这里每个循环的最后一步是58度退火【这一退火过程，它让完整扩增的产物，它的两端发生链内杂交。这样，3’端的序列就不能与新的、游离的引物发生杂交。这也就不会引新的、发起始于3’端的扩增，这样，就避免了完整扩整的产物的自我指数扩增。】

第一个循环下来，得到的是一批5’端有通用扩增序列的DNA片段。

在第二个循环完成后，所产生的扩增产物中，大部分是5’端有通用序列。而3’端，有与通用序列互补的序列的这些片段。

• 结果

MDA方法

全称：MultipleDisplacement Amplification，核心是用Phi 29 DNA聚合酶来进行直接的扩增

Phi 29酶的特点是，它可以把双链DNA进行解链，然后，在常温条件下，就把原始模板进行大量扩增。

比较

• MALBAC：扩增均一性更好、扩增DNA量相对较少（扩增效率相对比较低）、比较清楚地看到拷贝数变异
• MDA：扩增效率更高，实验方法更简单
• 大量细胞测序：均一性是最好，非常直观地看到拷贝数变异的情况

临床应用（主）

• 在胚胎植入前进行基因拷贝数变异检测。
• 进行肿瘤的染色体变异研究。