<aside> 🍁 核酸分子杂交

通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。

核酸分子（DNA或RNA）在变性以后（单链），在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程【DNA-DNA或DNA-RNA链杂交】。

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• [ ] 印迹技术固相支持物
  • 硝酸纤维素滤膜 （NC支持膜）
  • 尼龙膜
  • PVDF膜

<aside> 🍁 核酸探针

• 定义：能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子**【缺点：只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物】**
• 组成：标记（显示位置）+已知序列的核酸片断（与互补的待测序列杂交）、带有放射性的已知序列的核酸片断

制备探针

• 切口平移法
• 随机引物合成法
• 末端同位素标记（多核苷酸激酶）
• 取代合成法
• 反转录合成法

核酸探针的种类

• [ ] 按来源及性质划分：可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。

  cDNA探针

• [ ] 按标记物质划分：

  • 放射性同位素标记
  • 非放射性标记探针 </aside>

Southern blot

• 建立
• [ ] 利用标记的探针（probe）与转印膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针(序列已知)进行特异性的靶序列检测。用DNA（或RNA）探针检测DNA样品基因拷贝数
  • 特点：操作简单、结果十分灵敏
  • Southern Blot成功的关键
  • 应用：从基因库调出所需基因；基于蛋白结构合成探针，寻找编码蛋白的基因

<aside> 🍁 操作步骤

1. 从细胞或组织中用酚/氯仿反复抽提蛋白质并用无水乙醇沉淀的方法制备基因组DNA(gDNA)
2. 酶切DNA，凝胶**电泳（不加EB）分离各酶切片段，然后使DNA原位变性【凝胶放入盐酸**脱嘌呤（**目的条带大于15KD时**，短暂的脱嘌呤处理使DNA产生缺口将提高转移的质量）**，再放入NAOH溶液变性为单链，最后用PH为中性的缓冲液进行中和】**
3. 印迹：毛细转印或电转印并固定于NC膜（硝酸纤维素滤膜) / 尼龙膜上
   • 毛细转印法：虹吸作用+烘干固定
   • 真空转移法
   • 电转印
   • 膜的固定
4. 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。
   • 杂交和洗膜
5. 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。
6. 通过显影（放射自显影或非放射检测）检查目的DNA所在的位置。 </aside>

Northern杂交

• 建立
• [ ] 将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。用于研究样品中基因的表达（mRNA）
  • 应用

<aside> 🍁 过程

• 制备探针**【DNA，RNA或寡核苷酸】：根据mRNA序列合成同源DNA探针/ 以cDNA为探针**
• 提取总 mRNA**（亲和层析 纯化mRNA）**
• RNA根据大小分离（通过变性琼脂糖凝胶，例如乙二醛/甲酰胺**【甲酰胺：降低探针RNA相互作用的退火温度，从而防止由高温下的RNA降解】**)
• 将RNA 转移并固定 到固体支撑膜上**【Nylon 膜：带有正电荷的尼龙膜是最有效的用于在Northern印迹，因此与带负电荷的核酸具有高亲和性】**
• 将我们所需要的，能与探针序列互补的以及固定好的RNA序列与探针杂交【Northern杂交的方法包括**斑点杂交、印迹杂交**，两者都能鉴定外源基因是否得到转录，但后者还能确定mRNA分子质量大小及丰度】
• 将与固体基质非特异性结合的探针移去
• 检测，捕获和分析与分子探针特异性结合的RNA </aside>

衍生技术

<aside> 🍁 斑点杂交

直接将变性DNA样品点于硝酸纤维素膜（或尼龙膜）上，烘烤固定/ 紫外照射交联后先预杂交，再与标记探针杂交，然后通过高严谨性冲洗（低盐高温)，降低本底和提高特异性。放射自显影，判断是否有杂交或其杂交强度，主要用于基因缺失/ 拷贝数改变的检测。

预杂交和杂交可在密封袋中进行，密封袋比较方便，反应体积小，可以使用高浓度探针，封口前去除气泡，使杂交液与膜充分接触，反应体积以膜不贴壁、能浮动为宜。探针与同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂交。

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<aside> 🍁 原位杂交

菌落原位杂交（colony in situ hybridization）

1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理，对Southern印迹技术作了一些修改，提出了菌落原位杂交技术。

• 直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，经溶菌和碱变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，酸中和，洗蛋白，80C烘烤，再与特异性DNA探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落。对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落- - 通常应用于确定带有重组分子的细菌菌落中与探针同源的外源DNA插入片段

荧光原位杂交

<aside> 🍁 FISH（ fluorescence in situ hybridization)

是一种细胞遗传学技术，利用与待检测的染色体或DNA显微切片上的靶DNA相互补的核酸探针进行染色体水平上的原位杂交，可用于染色体上基因的定位。荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交【No Hybridization-> Detect Mutations】

• FISH应用：检测病原体

• 杂交的探针（DNA或RNA）如何避免与基因组DNA结合：探针设计时，选择杂交位点为跨内含子区段，即有两个外显子区段。 </aside>

• 固定剂

• RNA in situ hybridization (RNA原位杂交)

• Urothelial（泌尿的） cell's nuclei stained with DAPI and marked with four different FISH probes

RNA 原位杂交可以指出基因表达地点与水平。

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