甲基化测序 | Notion

DNA甲基化测序可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取甲基化状态信息和与基因表达调控的多重关系，可高效精确完成全基因组甲基化测序及高分辨DNA甲基化谱式绘制，并可对发现的靶点区进行甲基化特异性PCR验证。

DNA的甲基化：是在DNA的序列不变的条件下，在其中某些碱基上加上甲基的过程

结果：一般是使甲基化位点的下游的基因表达量变少

化学反应（核心）

这个（甲基化）分析方法当中的核心化学反应，是用亚硫酸氢盐来处理DNA。DNA当中，没有甲基化或羟甲基化的C碱基，就会被转化成U碱基。

在弱酸性条件下，亚硫酸氢根会结合到没有甲基化的C碱基的6位。而甲基化了的C碱基不会和亚硫酸氢根发生这个反应的。然后，用碱来处理。结合了亚硫酸氢根的非甲基化的C，就被脱氨基，并且脱亚硫酸根。然后，就被转化成U碱基。

Untitled

用亚硫酸氢盐来处理DNA，可以让99%左右的非甲基化的C碱基变成U。

经过亚硫酸氢盐转化过的DNA，再经过PCR，PCR新合成出来的链，U碱基的位置，就会被替换成了“T”。那么在接下来的测序过程中，测到的也是T碱基。

而甲基化的C，因为没有被亚硫酸氢盐所转化，所以，在接下来的测序过程中，被测到的，还是“C”碱基。

这样，通过测序，看一个位置是“C”，还是“T”。如果它保持是“C”，就说明这个位置是被甲基化、或者羟甲基化了。如果测到的是“T”，就说明这个位置是没有被甲基化、或者羟甲基化。

1. Truseq DNA建库方法

Untitled

Illumina Truseq DNA建库试剂盒当中，它所提供的接头，那么这个接头上的C碱基都是已经经过甲基化修饰了。

所以，用这些接头做出来的文库，在用亚硫酸氢盐做转化的过程当中，它的（接头上的）C还是保持是C ，不会被转成U。

带了这些接头的文库分子，就可以和测序芯片上的草皮DNA发生互补杂交。并且进一步发生桥式PCR反应。生成测序用的DNA的簇（Cluster）。

但是，这个方法有一个缺点，就是在用亚硫酸氢盐处理DNA文库的时侯，90%以上的DNA链会断掉。这样，已经建好的文库，其中90%分子会被破坏掉。也就是说文库的丰富度就会损失90%以上。

那么，相应的它有它的好处，它的好处就是，在这个建库过程当中用的PCR循环数较少。所以它PCR扩增效率不同，所引起的文库不均一程度也就较低。也就是我们通常所说的PCR bias较少。

Untitled

为了解决文库丰富度受到损失的这个问题，EpiCentre公司开发了EpiGnome方法

这个方法的优点是，把亚硫酸氢盐处理的过程，放在了建库之前。这样建成的库的丰富程度会比较高。但是这个方法也有缺点，缺点就是要做较多的PCR循环，那么有了比较多的PCR循环之后，PCR产物的扩增均一性是不太好的。也就是说PCR bias会比较大。