所有关于氨基酸的分离手段都建立在它们在物理性质（大小）或化学性质（电荷）的差别的基础之上。用于分离、纯化氨基酸的主要手段是电泳和层析。
利用混合物中各组分理化性质的差异（如分配系数、吸附力、分子形状及大小、分子亲和力等），使各组分在两相（固定相 + 流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
AA与树脂结合的牢固程度(亲和力)取决于 1.静电吸引 2. AA侧链与苯乙烯间的疏水相互作用
例如:pH=3时，AA与阳离子交换树脂之间静电引力的大小:
碱性AA (R2+) >中性AA (R+) >酸性AA；洗脱顺序:酸性AA，中性AA, 碱性AA
其机理是分子筛效应，主要根据蛋白质分子大小进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，混合样品如同“过筛“样，按分子大小不同彼此分开。
例：今有a、b、c、d四种蛋白质，其分子体积由大到小的顺序是a>b>c>d，在凝胶过滤柱层析中，最先洗脱出来的蛋白质一般应该是
a, b, c, d
例：指出从分子排阻层析柱上洗脱下来下列蛋白质时的洗脱顺序，为什么？分离蛋白质的范围是5,000-400,000。
肌红蛋白（马心肌） 16900 过氧化氢酶（马肝） 247500 细胞色素c（牛心肌） 13370 肌球蛋白（鳕鱼肌） 524800 糜蛋白酶原（牛胰） 23240 血清清蛋白（人） 68500
#超出分离范围的Pr无法分离，先下来（混合）
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