PCR偏差：

单个细胞含有约10pg total RNA，而约80%以上信息为rRNA，从单细胞RNA到文库意味着核酸的扩增量要达到百万倍以上。而在这个高的扩增量不引入PCR偏差一直是个较大的问题。

所谓PCR偏差，就是在PCR扩增过程当中，某些片段被大量扩增，而大部分片段被扩增的量很少，甚至根本就没有被扩增。结果就导致高通量测序，只能测到这所有样本当中很少一部分的片段序列。

PCR偏差会随着PCR循环的次数的增多而指数放大。那么，在这种情况下，一方面要把核酸扩增几百万倍，甚至更多的倍数；另一方面，又想得到均一覆盖的文库，这就是单细胞mRNA建库当中，所要解决的第一个大难题。

我们可以想一下，如果两个样本基因表达量是相同的，但扩增效率A是99%，B是97%，在扩增30个循环后，两者在扩增后的表达就有了1.84 (0.99^30/0.97^30) 倍的差异。而当我们分析差异基因的时候如果选1.5倍作为差异基因的标准，那么本来没有差异的基因也会出现差异。

去除rRNA：

rRNA (核糖体RNA)在total RNA占比-般在80%以上，如果不加区分地进行逆转录，再扩增、建库很可能测序得到的绝大部分序列都是rRNA的序列，但是一 般情况下，rRNA序列不能给我们带来有效的信息，可以说它是无用的。

这样，如何能够选择性地把mRNA转化成测序文库，并且避免把rRNA带到测序文库中来，这就是单细胞mRNA测序当中，要解决的第二个大难题。