三代测序：三代测序技术是指单分子测序技术，在测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，也叫单分子实时DNA测序。主要可以分为单分子荧光测序和纳米孔测序。

• 三代测序优势：第三代基因测序读长较长，可以减少拼接成本，节省内存和计算时间；作用原理上避免了 PCR 扩增引入错误 ——- 拓展应用: RNA的序列，甲基化的DNA序列等
• 三代测序缺陷：单读长的错误率偏高，需重复测序以纠错 (增加测序成本)；依赖DNA聚合酶的活性；成本较高(二代lllumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元)；生信分析软件不够丰富、数据积累少

（1）单分子荧光测序技术

代表是美国螺旋生物(Helicos)的SMS技术和美国太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。其通过将脱氧核苷酸用荧光标记，实时地记录荧光的强度变化。当荧光基团被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

测序过程包括文库构建和上机两步。文库构建是将长片段DNA分子与测序接头连接成茎环结构，然后加上与接头互补的测序引物及DNA聚合酶。上机测序是将构建好的文库复合物载入SMRT Cell的纳米孔中，通常一个纳米孔固定一个DNA分子，DNA聚合酶通过共价连接的方式固定在纳米孔底部。

PacBio SMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是： DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记 4 种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个 DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。

• 关键：将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来——零模波导孔原理

（2）纳米孔测序技术

代表是英国牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，四种核苷酸的空间构象不一样，因此当它们通过纳米孔时，所引起的电流变化不一样。由多个核苷酸组成的DNA或RNA链通过纳米孔时，检测通过纳米孔电流的强度变化，即可判断通过的核苷酸类型，从而进行实时测序。

基本原理：当纳米孔充满导电液时，两端加上一定电压，分子模板通过纳米孔生成可测量电流。纳米孔的直径只能容纳一个核苷酸，单链模板就会在电场作用下依次通过纳米孔而引起电流强度变化，通过检测相应的电流峰判断碱基，实现实时测序。

主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb；错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端;数据可实时读取；通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成)；起始DNA在测序过程中不被破坏；以及样品制备简单又便宜。理论上，它也能直接测序RNA。 　　纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。并且改方法的测序准确性可达99.8%，而且一旦发现测序错误也能较容易地进行纠正。